줄기세포 유래 간세포에서 성숙한 간 유전자 발현 평가 가이드

간

줄기세포 유래 간세포

줄기세포를 간세포 유사 세포(HLCs)로 분화하는 것은 기초 연구, 약물 및 독성 연구, 임상 응용에 큰 가능성을 가지고 있습니다. 광범위한 성숙한 간 기능을 가진 완전히 성숙한 간세포를 생성하는 배아 줄기세포 또는 유도 다능성 줄기세포와 같은 줄기세포로부터 HLC를 생산하기 위한 프로토콜은 현재 없습니다. 이 보고서는 정량적 RT-qPCR에 의한 간 유전자 발현을 분석하여 중간 정도의 높은 처리량 포맷으로 줄기세포 유래 HLC의 성숙도를 평가하는 표준 방법을 설명합니다. 이 방법은 또한 17개의 태아와 25개의 성숙한 인간의 간에서 생성된 정상 간에서 발현되는 62개의 유전자의 강력한 데이터 세트를 제공하여 연구자들이 줄기세포에서 파생된 HLC에서 이러한 유전자의 발현을 진짜 태아와 성숙한 인간의 간에서 얻은 값과 빠르고 쉽게 비교할 수 있도록 합니다. 이 연구에서 설명된 간단한 방법은 분화 프로토콜의 유효성에 대한 빠르고 정확한 평가를 제공하고 분화 조건의 최적화를 안내하는 데 도움이 될 것입니다.

간의 역할

간은 신진대사, 영양소 저장, 해독을 포함한 다양한 기능을 수행하므로 신체에서 기본적인 역할을 합니다. 생명을 위협하는 간질환의 결정적인 치료법은 OLT입니다. 불행히도 이식 가능한 간 수요는 기증된 사체의 공급을 점차 앞지르고 있으며, 이로 인해 대기 시간이 길어지고 이식 대상자의 사망률이 증가하고 있습니다. 간세포 이식은 OLT의 대안으로 간 기능부전 환자를 지원하는 방법으로 사용되었습니다. 간세포 이식은 후천성 및 유전성 간질환의 치료제로 인식되며, 주로 사용 가능한 장기를 기다리는 환자들의 가교 역할을 합니다. 그러나, 질 높은 기증 장기의 낮은 가용성과 낮은 증식 용량 및 체외에서 성숙한 기능을 유지할 수 없는 능력으로 인해 사용이 제한된다. 이러한 모든 이유는 간세포의 추가 공급원의 식별의 필요성을 강조합니다. 1차 간세포의 잠재적 대안은 만능 또는 다른 줄기세포에서 파생된 간세포 유사 세포(HLC) 일 수 있습니다. 유도 만능 줄기세포(iPSC)의 생성은 전사 인자의 강제적 발현에 의해 윤리적 우려를 제기하지 않고 다른 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력을 가진 잠재적으로 무한한 다기능 세포의 원천을 제공합니다. 간 분화를 위한 초기 프로토콜은 배아체 형성과 특정 성장 인자를 추가한 자발적 분화를 기반으로 했습니다. 이 접근방식은 간단하지만 비효율적이며 여러 셀 유형의 모집단을 생성하는 경우가 많습니다. 나중에 프로토콜은 성장 인자와 중요한 것으로 확인된 세포 외 기질로 표적 분화 실험을 수행했습니다. 간세포가 내배엽 계통의 조상을 가지고 있기 때문에 대부분의 프로토콜은 내배엽 유도로 시작합니다. 내배엽 유도의 경우 ActA, Wnt, BMP4와 같은 여러 화합물이 필수 성분으로 나타났습니다. 기존의 2D 배양 외에, 보다 최근의 간 분화 프로토콜에는 분화를 강화하기 위한 현탁액, 3D 유기체 또는 구상체 배양 등이 포함됩니다. 이러한 접근법은 연구 및 치료 응용, 약물 발견 및 재생 의학 모두에 큰 가능성을 가지고 있습니다. 만능 선원에서 생성된 HLC는 질병 모델링, 약물 대사, 바이러스 감염 및 복제, 비 코딩 RNA 연구, 약물 유도 간 손상 등과 같은 다양한 애플리케이션에 사용되었습니다. 대부분의 분화 프로토콜은 약물 대사 능력, 요소 주기 활성 또는 담즙산과 리포단백질 합성 및 배설을 포함한 다양한 성숙한 간 기능과 관련하여 완전히 성숙한 간세포를 생성하지 않습니다. 대부분의 최신 프로토콜에 의해 생성된 세포는 태아 간에서 특징적인 수준으로 유전자를 발현하고 보다 태아 같은 표현형을 나타냅니다. 많은 발표된 보고서에서는 줄기세포 유래 간세포의 유전자 발현을 진짜 인간 간세포 또는 인간 간과 비교하지 않으며, 실제 간세포 또는 인간 간 조직의 하나 또는 소수의 인간 사례로 보고서가 제한되는 경우가 많습니다. 많은 분화 프로토콜, 간 기능을 평가하기 위한 다양한 방법 및 양성 대조군으로서의 다른 간 사례로, 한 출판물의 데이터를 비교하는 것은 불가능하며 HLC의 유전자 발현 수준이 정상적인 인간 생활에서 관찰될 수 있는 값과 어떻게 비교되는지를 결정하는 것은 동등하게 어렵습니다. 이 필드는 모든 연구자가 이용할 수 있는 다수의 인간 간에서 생성된 강력한 데이터 세트와 결합된 간 유전자 발현을 평가하는 표준 방법에 의해 제공될 것입니다. 따라서 그들은 샘플의 유전자 발현 수준을 일반 인간 간과 빠르고 쉽게 비교할 수 있습니다. 본 연구에서는 17개의 태아와 25개의 성숙한 간 샘플 세트에서 보통 간에서 발현되는 60개 이상의 유전자의 mRNA 발현에 대한 정량적 RT-qPCR 데이터를 제시합니다. 또한, 우리는 표준 간 데이터 세트와 비교하여 자체 실험실에서 iPSC에서 파생된 HLC와 3개 회사에서 상용화된 HLC의 발현 프로파일을 시연합니다. 데이터는 상업적으로 이용 가능한 유전자 발현 분석을 통해 생성되었으며, 이러한 방법과 포함된 데이터 세트를 HLC 성숙도 평가에 대한 지침으로 사용할 수 있게 되었습니다.

간 유전자 발현 평가 가이드

태아 임신 연령은 몇 주 또는 며칠 후에 제공됩니다. 산후 간 샘플 중 10세 미만의 기증자로부터 얻은 경우는 1건뿐이며, 그 경우 5.5세 남성의 조직은 분석된 다른 성숙한 간 샘플 내에 잘 들어맞는 유전자 발현 프로파일을 보였습니다. 이러한 이유로, 우리는 이 산후 그룹의 조직 샘플을 성숙한 인간의 간을 나타내는 것으로 설명합니다. 최종 간 분화 사진은 HLC가 3D 구상체로부터 설명하여 2D 배양으로 부착하도록 하여 촬영되었으며, 사진 및 형태학적 분석만을 위한 것이었습니다. 표의 유전자 발현에 대한 데이터는 유기 세포에서 직접 생성되었습니다. 간은 수많은 분자의 합성, 영양소와 이생균의 대사, 다양한 분자의 제거, 대사산물의 분비, 저장 및 방출, 그리고 내장의 항원과 미생물의 중화 등 다양한 기능을 수행합니다. 간이 수행하는 다양한 기능을 고려할 때, 중요한 간 유전자의 발현에서 돌연변이나 변화가 어떻게 간 기반 질병으로 이어지는지를 이해하는 것은 쉽습니다. 현재 말기 간질환 환자의 최종 치료제는 OLT입니다. 간세포 이식이 성공하면 OLT에 비해 몇 가지 장점이 있는데, 이는 최소한의 침습적 시술이며, 자연 간은 제거되지 않는다는 점에서 세포 이식 손실 시 환자가 이전 상태로 돌아간다는 것을 의미합니다. 또한, 자연 간에서 감소하거나 기능이 없는 효소 활성이나 기능은 간 질량의 극히 일부만 이식하는 것으로 대체될 수 있습니다. 그러나 이 치료의 혜택을 받을 수 있는 모든 개인에게 이식을 수용하기에 충분한 수의 건강한 간세포가 없습니다. 또한 세포치료에 이용 가능한 간 조직의 품질은 최적이지 않은 경우가 많고, 1차 간세포가 시험관내 증식할 수 없고, 저온 보존 손상에 대한 감수성은 1차 세포 사용에 추가적인 부담을 줍니다. 간질환 치료를 위한 새로운 간세포 공급원에 대한 요구가 충족되지 않았습니다. 줄기세포 연구의 최근 발전은 배아 줄기세포나 iPSC에서 HLC를 생성하는 것에 대한 열정을 불러일으켰는데, 후자는 아마도 면역 억제 치료의 필요성을 제거할 수 있는 자가 이식을 위한 세포의 생성 가능성뿐만 아니라 윤리적 관심의 결여로 인해 선호될 것입니다. 그러나 불완전 분화로 인한 종양 형성의 위험, 과도한 세포 배양 비용, 의미 있는 수준으로 생산을 확대하는 어려움 등 구현에 몇 가지 장애물이 있습니다. 마찬가지로 중요한 관심사는 성숙한 간세포와 유사한 성숙한 HLC를 생성하기 위한 분화 프로토콜의 효과입니다. 분화 절차를 더욱 최적화하기 위해서는 줄기세포 유래 HLC의 성숙도를 평가하기 위한 실용적이고 정확한 도구가 필요합니다. 본 연구에서는 17개의 태아와 25개의 성숙한 간에서 60개 이상의 간, 다능성 및 발달 유전자의 발현을 보고합니다. 특정 TaqMan 프라이머와 프로브 및 RT-qPCR 조건의 사용을 포함하여 이 연구에서 제시된 특정 방법을 따른다면, 다른 실험실의 연구자들이 그들의 HLC의 유전자 발현 수준을 빠르고 정확하게 평가하고 이러한 태아 또는 성숙한 간 조직에서 발견되는 수준과 비교할 수 있을 것입니다. 연구의 요점은 최적의 분화 절차를 제공하는 것이 아니라 어떤 실험실의 분화 프로토콜에서 샘플의 유전자 발현 수준을 결정하는 메커니즘을 제공하고 HLC와의 결과를 진짜 태아와 성숙한 유전자 발현과 비교하기 위한 풍부한 데이터 세트를 제공하는 것이었습니다. 인간의 간 분석에는 3개의 기업으로부터 생산되는 셀과 자사 연구소에서 생산되는 3개의 복제 샘플이 포함되어 분석을 실시해, 그 결과를 표시·해석하는 방법을 실증하고 있습니다.