망막과 각막에 효율적인 효율적인 유전자 전달을 위한 조작된 캡시드

눈의 각막

눈 질환에 대한 유전자 치료

아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터는 인간 유전자 전달을 위한 이상적인 매개체를 나타냅니다. AAV 벡터 시스템의 한 가지 장점은 다양한 표적 세포에 선택적인 트로피즘을 제공하는 여러 자연적으로 발생하는 혈청형을 이용할 수 있다는 것입니다. 자연 AAV 분리막의 특성을 향상하는 전략이 개발되었으며 합리적인 설계 또는 방향 진화의 두 가지 접근법으로 나눌 수 있습니다. 합리적인 설계 접근법은 AAV 캡시드에 대한 지식을 활용하여 전달 효율 또는 특이성을 변경하기 위해 캡시드에 표적 변경을 하는 반면, 방향 진화 접근법은 캡시드 구조에 대한 사전 지식을 요구하지 않으며 무작위 돌연변이 생성, 캡시드 셔플링 또는 무작위 펩타이드 삽입을 포함합니다. 본 연구에서는 합리적인 설계 접근법과 AAV 수용체 결합, 표면 전하 및 AAV 캡시드 단백질 번역 후 수정에 대한 지식을 사용하여 AAV2와 AAV5 모두에 대한 새로운 변형 생성을 설명합니다. 새로운 AAV2 및 AAV5 변형은 마우스 망막과 각막 모두에서 개선된 전달 특성을 보여줍니다. 새로운 AAV2 변이체의 번역 충실도는 인간이 아닌 영장류(NHP) 망막의 맥락에서 확인된 반면, NHP 조직 설명 모델은 AAV5 변이체에 대한 종 간 번역 충실도를 신속하게 평가할 수 있도록 확립되었습니다. 본 연구에서 조작된 캡시드로 변형된 AAV2 및 AAV5 변이체는 다양한 인간의 눈 질환에 대한 유전자 치료에서 잠재적으로 사용될 수 있는 효능 및 특이성을 추가할 새로운 속성을 가지고 있습니다.

조작된 캡시드

안구 질환에 대한 아데노 관련 바이러스(AAV) 유전자 치료 벡터의 성공적인 임상 적용이 입증되었으며 이제 안구 유전자 치료 제품이 현실화되었습니다. 특히 미국 식품의약국(FDA)의 승인을 받아 미국 시장에 진출한 최초의 인간 유전자 치료제는 레버의 선천성 아마로시스2인 유전성 망막디스트로피 치료제인 룩스터나였습니다. 진행 중인 수많은 임상 및 비임상 연구는 AAV 벡터 시스템의 효용성을 더욱 강조하며, 다양한 망막 세포 트로피즘을 나타내는 다양한 자연 발생 혈청형의 가용성은 망막에 대한 치료 유전자를 목표로 하는 효과적인 도구로 간주됩니다. 눈을 위한 전달 수단, 그리고 다양한 망막 세포 트로피즘을 보여주는 다양한 자연 발생 혈청형의 가용성은 망막에 대한 치료 유전자를 목표로 하는 효과적인 도구로 간주됩니다. 1세대 캡시드의 단점은 후 망막 유전자 치료의 맥락에서, 그들의 전달은 침습적인 망막하 수술을 필요로 한다는 것입니다. 따라서 덜 침습적인 전달 경로의 필요성을 해결하기 위해, 연구는 외부 망막을 전달할 수 있는 AAV 벡터를 개발하는 데 초점을 맞추고 있습니다. 또한, 눈의 앞쪽 방, 특히 각막 내피 세포에 유전자를 전달하는 것은 마찬가지로, 뇌내 전달 또는 각막 천공보다 덜 침습적인 수술 절차로부터 이익을 얻을 것입니다. 특히 AAV 벡터의 체외 및 망막하 전달은 모두 용량 의존적 염증과 관련이 있으므로 효율이 향상된 엔지니어링 캡시드에 대한 중요한 발전은 효능을 손상시키지 않고 면역원성 및 용량 문제를 해결할 수 있는 능력입니다. 차세대 캡시드를 식별하는 전략은 크게 합리적인 설계와 방향 진화의 두 가지 접근 방식으로 나눌 수 있으며, 후자의 접근 방식은 원하는 속성을 가진 캡시드를 식별하기 위해 복잡한 AAV 캡시드 라이브러리의 반복적인 선별을 포함합니다. 또한, 유도 진화 접근법은 캡시드 단백질의 기본 구조-기능 관계에 대한 지식을 필요로 하지 않습니다. 대조적으로, 합리적인 설계는 AAV 캡시드의 구조와 기능에 대한 지식을 필요로 하며, 이 전략을 사용하는 진보는 1세대 AAV의 구조를 해결하기 위해 X선 결정학과 저온 전자 현미경을 사용함으로써 촉진되었습니다. 구조 지식은 AAV 벡터의 특정 표적화를 위한 맞춤형 캡시드를 개발하기 위한 기초를 제공합니다. AAV 캡시드 표면의 도메인과 특정 세포 수용체의 상호작용은 다양한 AAV 혈청형에 대한 조직 열대성을 지시하며, 다른 AAV 혈청형은 고유 세포 수용체를 사용합니다. 예를 들어, AAV2의 주요 수용체는 헤파란 황산 프로테오글리칸(HSPG)인 반면, AAV5의 수용체는 α-2-3-N-결합 시알산 및 혈소판 유래 성장 인자 수용체로 확인되었습니다. 이전에, 우리와 다른 사람들은 표준 헤파란 황산염(HS) 결합 잔기가 없는 AAV2 변형을 설명했습니다. 이러한 AAV2 변이체는 망막하에서 전달될 때 매우 효율적인 광수용체 전달을 매개하는 것으로 나타났는데, 이는 망막하 전달을 가진 광수용체 세포에 대해 제한된 열대성을 보이는 부모인 헤파란 설페이트 결합 AAV2와 매우 대조적입니다. 따라서 수용체 결합 및 열대성의 구조 결정 인자에 대한 지식은 원하는 전달 프로파일을 가진 변형을 생성하기 위해 캡시드를 수정하기 위한 통찰력을 제공합니다.

안구 질환에 대한 유전자 치료

우리는 AAV 수용체 결합, 표면 전하 및 캡시드 단백질 PTMs에 대한 합리적인 설계 접근법과 지식을 사용하여 망막 및 각막에 대한 새로운 열대성 및 전달을 가진 AAV 변형이 생성될 수 있음을 보여주었습니다. 이전에, 우리는 마우스 망막과 중추 신경계(CNS)의 맥락에서 AAV2-HBKO 변이체의 개선된 전달 성능에 대해 보고했습니다. AAV2-HBKO 변이체는 캡시드의 영역에서 AAV2가 관련 수용체인 HSPG에 결합하는 것을 용이하게 하는 주요 표면 아르긴이 돌연변이를 가지고 있습니다. 이 헤파란 결합 녹아웃 변이체는 마우스 CNS와 망막에서 새로운 전이 패턴을 보여주었고, 20개의 후속 연구에서 새로운 CNS 전이 특성은 NHP 뇌로 번역되는 것으로 확인되었습니다. 그러나, AAV2-HBKO 변이체의 마우스에서 NHP 망막으로의 전이 성능의 번역 가능성은 확인되지 않았습니다. 이 연구에서, 우리는 AAV2-HBKO 변이체가 동일한 벡터가 마우스나 NHP 중 하나에 자궁 아래로 전달되었을 때 외부 망막에 높은 수준의 전달 및 유전자 발현을 나타냈다는 것을 보여줍니다. 이전에, AAV2 벡터의 NHP 망막으로의 하위 망막 전달은 대부분의 트랜스젠더 발현이 RPE로 제한된 제한된 광수용체 세포 전달을 보여주었습니다. 이것은 인간 RPE65 트랜스젠더의 유비쿼터스 CBA 프로모터 구동 발현의 맥락에서 입증되었습니다. 따라서 AAV2 기반 벡터의 HS 결합을 절제하는 것은 영장류 광수용체에 대한 생물 분포를 강화하는 효과적인 전략입니다. 로드 광수용체에 대한 트랜스젠더 발현의 추가적인 제한은 로돕신 프로모터의 사용으로 달성되었습니다. 막대 광수용체 전이는 망막하엽의 영역 전반에서 관찰되었으며, 원추형이 풍부한 영역에서는 전달이 극적으로 감소했습니다. NHP 망막 연구에서 AAV2-HBKO 변이체의 전달 프로파일은 동일한 eGFP 발현 카세트를 보유한 AAV5 벡터의 것과 비교되었으며, 로드 광수용체의 전달 정도가 두 벡터, 특히 NHP 눈에서 동일함에도 불구하고 AAV2-HBKO 벡터는 보를 지나 확산하는 능력을 보여주었습니다. 망막하 엽의 rder. 이것은 생체내 영상과 사후 조직학 모두에서 확인되었습니다. 현재의 연구는 생쥐가 아닌 종에서 망막에서 우리의 새로운 변종들의 변환 활성의 신속한 평가를 용이하게 한 NHP 망막 유기형 탐사 시스템의 최적화를 설명합니다. AAVPHP는 생쥐에서 NHP 뇌로의 변환 부족이 보고되었습니다. 따라서 이 선례와 함께 마우스 망막에서 AAV5S194G의 개선된 전달 활성이 NHP 광수용체로 변환되는지 확인하고자 했습니다. AAV5를 사용하여 NHP 이식 모델의 충실도를 확인하였고, 탐사 모델에서 AAV5S194G 변종의 우수한 변환 활성을 입증하였습니다. 특히 NHP 망막 모델에서 AAV5S194G 변종 평가에서 이 캡시드에 대한 추가적인 이점이 밝혀졌습니다. AAV5S194G 변환은 영장류 광수용체에서 주로 이루어지며, 반면 부모 AAV5는 NHP 모델에 대한 광수용체, INL 및 GCL 하나 주의사항입니다. 새로운 AAV 캡시드에 대한 gical 발견은, 그러나, 모델은 인간 망막 질환의 치료를 위한 AAV 캡시드의 잠재적 번역 가능성에 대한 통찰력을 제공합니다. 결론적으로, 본 연구는 안구 유전자 치료를 위한 AAV 벡터의 효과를 목표로 하고 개선하기 위해 캡시드를 엔지니어링하기 위한 합리적인 설계 접근법의 유용성을 강조합니다. AAV 수용체 결합, 표면 전하 및 PTMs에 대한 사전 지식은 각각 개선된 망막 확산, 새로운 각막 세포 대류증 및 증가된 광수용체 전달을 제공하는 최적화된 캡시드의 설계에 적용되었습니다. 중요한 것은, 이러한 새로운 캡시드가 제공하는 속성들은 다양한 인간의 안과 질환에 대한 유전자 치료에서 그들의 잠재적인 사용의 효과, 특이성, 그리고 안전을 더해줄 것입니다.