유전자 치료에서 AAV 동원의 위험성

유전자

AAV 동원

재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 벡터 동원은 완전한 AAV 벡터가 도입된 세포로부터 퍼지거나 동원되어 초기 숙주 내부 또는 외부의 추가 세포를 감염시키는 광범위한 이론적 과정입니다. 이 과정은 도우미 바이러스에 의존하지 않거나 도우미 바이러스에 의존할 수 있습니다. 여기서 wtAAV의 유무에 관계없이 rAAV의 생성 및 이동은 잘 확립된 체외 조건과 분석 측정을 이용하여 플라스미드 전이 또는 바이러스 전이 후에 분석되었습니다. 시험관내 생산 동안 wtAAV는 rAAV-luc(4.1kb), rAAV-IDUA(3.7kb), rAAAV-나노디스펠린(4.9kb)으로 각각 2.5배, 5.9배 또는 10.7배 낮은 양을 생성했습니다. 놀랍게도, wtAAV와 rAAV 플라스미드의 공동 전달은 모든 경우에서 rAAV의 생산이 균일하게 감소하여 조사된 모든 구조에 대해 wtAAV:rAAV 역가가 1:1의 비율이 되었습니다. 이러한 결과는 rAAV 트랜스제닉 시퀀스, 크기, 트랜스젠더 또는 프로모터 선택과 무관한 것으로 나타났으며, 아직 정의되지 않은 현재 벡터 생산 시스템을 향상하는 wTAAV 보완의 새로운 측면을 지적합니다. 동원 분석에서 감염된 293 세포 용해물에서 회수된 상당량의 rAAV는 손상되지 않은 상태로 유지되었으며 2차 감염(Ad 독립 동원이라는 용어)에 적합했습니다. Ad와 wtAAV가 공존하는 rAAV 감염 세포에서 rAAV 입자 생성은 Ad 조건이 없는 것에 비해 50배 이상 증가하였습니다. 또한 Ad 의존성 rAAV 벡터가 동원되어 후속 2차 감염 시 1,000배 이상의 전이를 초래하여 다양한 조건에서 나타날 수 있는 이러한 이론적 안전 문제의 현실을 강조했습니다. 전반적으로, 이러한 연구는 동원 저항 벡터의 필요성과 더 나은 벡터 생산 시스템을 도출할 수 있는 기회를 문서화하고 나타냅니다.

아데노 바이러스 설명

1965년 Atchison에서 아데노바이러스(Ad) 제제 오염물질로 처음 확인되었습니다. 4.7kb의 선형 DNA AAV 게놈은 각각 게놈 복제와 캡시드 생산에 관련된 단백질을 인코딩하는 rep와 cap을 포함하여 여러 개의 개방형 읽기 프레임(ORF)을 측면에 배치하는 역단자 반복(ITR)으로 구성됩니다. AAV 복제가 완전히 이해되지는 않았지만, ITR은 복제 기원 역할을 하며 Rep 단백질과 함께 작동하며, 그중 가장 큰 단백질은 복제 과정의 초기 단계로 ITR에 직접 결합하고 특정 단일 가닥 닉을 유도합니다. 전통적으로 AAV는 보조 바이러스의 공동 감염이 필요한 복제 결함 바이러스로 간주되며, 그중 몇 가지는 자연 수명 주기의 완료로 확인되었습니다. 도우미 바이러스가 없는 경우, 보고된 ORF의 발현이 거의 일어나지 않으므로, AAV 게놈은 최소한으로 복제되고 잠재되어 있습니다. 그러나, 도우미 바이러스가 없는 경우의 AAV 복제는 세포 스트레스 및/또는 특정 유형의 세포 및/또는 세포 주기의 단계 동안 보고되었습니다. 야생형 AAV2(wtAAV2) 게놈은 1980년대 9-11년에 여러 플라스미드 구조로 복제되었으며, 이러한 구조는 대부분의 재조합 AAV(rAAV) 벡터 구조의 부모 플라스미드 역할을 합니다. 재조합 AAV에서 혈청형 2(ITR)의 ITR은 최소 rAAV 게놈 복제 및 캡시드 포장에 필요하기 때문에 측면 유전자 카세트인 유일한 바이러스 시스 요소입니다. 현재 AAV 벡터는 악마의 성공으로 생체 내 인간 유전자 치료에 가장 유망한 전달 방법입니다. AAV 기반 유전자 치료법의 인기에도 불구하고, 인간 환자에 대한 벡터 유도 유전자 변형의 영향 외에도, wTAAV 및 rAAV 생물학의 거의 모든 측면에 대한 해답이 없는 질문들이 남아있습니다. 대부분의 보고된 사례에서 보조 바이러스뿐만 아니라 Rep 단백질이 필요하기 때문에 rAAV 벡터 자체는 복제가 부족합니다. 그러나 rAAV 게놈 복제 및 캡시드 포장을 위해 트랜스에서 Rep 및 Cap 단백질을 공급할 수 있는 wTAAV가 인간 집단에서 널리 사용되고 있습니다. wtAAV 또는 rAAV에 도움 기능을 제공하는 단순 헤르페스 바이러스 또는 Ad와 같은 다른 병원성 바이러스에 의한 초감염은 인간 환자 집단에서도 흔합니다. 예를 들어, 외부 기관으로서의 눈은 유전자 치료 대상으로서 독특한 이점을 제공하며, 그중 25개는 바이러스 감염에 더 취약하게 만듭니다. 기존 보고서에 따르면 HSV에 의해 발생하는 헤르페스 각막염은 미국에서 가장 흔한 각막 감염으로 연간 50,000건의 신규 및 반복 사례가 진단됩니다. 또한 여러 Ad 혈청형이 결막과 각막을 감염시키며 모든 각결막염의 92퍼센트를 담당합니다. rAAV 동원은 완전한 AAV 벡터가 전이된 세포로부터 퍼지거나 동원되어 초기 숙주 내부 또는 외부의 추가 세포를 감염시키는 광범위한 이론적 과정입니다.

AAV 동원의 위험성

rAAV는 수많은 다양한 질병을 다루는 수백 개의 임상시험을 통해 인간 유전자 치료에 가장 많이 사용되는 전달 포맷 중 하나가 되었습니다. 실제로 현재 유럽과 미국 식품의약국(FDA)의 승인을 받은 rAAV 약물은 3종이며 FDA의 추정치는 2025년까지 10~20종의 새로운 유전자 치료제가 승인될 것으로 예측했습니다. 일반적으로 임상 응용에서 긍정적인 치료 결과가 얻어졌으며, 전반적으로 AAV 유전자 치료는 강력한 안전성을 확보했습니다. 그러나 AAV 벡터의 치료적 사용과 관련하여 새롭게 특성화된 우려는 캡시드와 트랜스제닉 생성물 면역원성과 염색체 통합의 입증과 종양 발생 가능성과 치료 대상에서 표적 외 전이와 관련된 잠재적 합병증을 포함합니다. rAAV 배출로 인한 비환자 방관자들을 이용하여 놀랍게도, rAAV 벡터와 관련된 또 다른 광범위한 이론적 관심사인 rAAV 동원은 AAV 연구 커뮤니티에서 수십 년에 걸쳐 희소 보고서만으로 과소평가되어 왔습니다. wTAAV는 생산 중에 RAAV보다 더 나은 수율을 가진 것으로 보고됩니다. 그러나, 73년에, 유전자 치료 환경에서, 세포가 rAAV에 의해 도입되고 wtAAV와 도우미 바이러스에 의해 공존 또는 초감염될 때, wtAAV가 복제 및 캡시드 포장에 대한 이점을 유지하는지 여부가 불확실하여 환자에서 혁신적인 AAV 생성을 잠재적으로 억제합니다. 현재 연구에서, 이러한 우려의 현실은 몇 가지 새로운 발견과 함께 세포 배양의 전달 및 전달 맥락 모두에서 정량적으로 조사되었다. 첫 번째는 직렬 전달을 초래하는 Ad-독립적 rAAV 동원이 상당합니다. 두 번째는 wTAAV와 rAAV가 모두 존재하는 경우, 다음 발견이 있습니다. 생산을 위한 wtAAV와 rAAV 사이의 명백한 편향이 있습니다. 그러나 용량 의존적 효과가 존재합니다. 복제 의존적 이동은 Ad 독립적 이동에 비해 1,000배 이상 높은 직렬 변환을 초래합니다. 여기서 생성된 데이터는 AAV 유전자 치료 치료를 받은 환자가 rAAV를 생성하고 전파할 수 있는 잠재력을 노출시키고, 따라서 벤조나아제 내성 wTAAV 서열 오염 및 아마도 더 안전한 동원 내성 AAV 벡터를 완전히 제거하는 더 나은 벡터 생성 프로토콜의 개발의 필요성을 강조합니다. 또한, wtAAV 플라스미드의 존재 하에서 rAAV 생산을 증가시키는 아직 정의되지 않은 측면이 보고되었습니다. 결론적으로, 집단 데이터는 rAAV 동원의 실용적 위험을 강조합니다. 또한 환자에서 시간이 지남에 따라 감소된 캡시드 중화 항체 반응의 증거는 rAAV 동원의 위험을 다시 자극합니다. 이 분야가 표적화, 열대성 및 더 광범위한 질병을 치료하는 능력을 위한 보다 효율적인 AAV 벡터로 진행됨에 따라, 여기에 있는 데이터는 안전 문제에 대한 개념 증명을 제공하고 동원 저항성 AAV 벡터의 필요성을 강조했습니다. 한 가지 방법론은 실험실 환경에서만 효율적인 AAV 벡터 생성을 허용하는 방식으로 rAAV ITR 시퀀스를 변경하는 것입니다. 이 개념은 wTAAV5가 여전히 인간 집단에 존재하지만, 복제에 저항하는, 일반적인 Rep 2 또는 여러 다른 AAV 혈청형에 의해 시작된, 더 희귀한 ITR5 서열을 사용하는 벡터 게놈이 생성되고 테스트된 이전 보고서에 의해 부분적으로 지지되었습니다. 궁극적으로, 복제에 저항하는 합리적으로 설계된 ITR자연적으로 발생하는 모든 Rep 단백질에 의한 /이동은 새로운 실험실 제한 Rep 유사 단백질에 의한 높은 역가 생산을 가능하게 하지만, 여기서 강조된 rAAV 이동 문제를 극복할 수 있을 것이며, 그러한 시약은 이미 적극적인 조사가 진행 중입니다.