혈우병 A의 유전자 최료를 위한 최소 유효 용량 결정

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출혈성 질환 혈우병 A

출혈성 질환인 혈우병 A는 남성 5000명 중 1명에게 영향을 미칩니다. 인간 혈액 응고 인자 VIII(hFVIII)의 결핍으로 인해 발생합니다. 쥐와 마카크를 대상으로 한 연구에서 AAVhu37이 확인되었습니다. E03.TTR.HFVIII Co-SQ.PA75는 혈우병 A를 치료하기 위한 임상 후보 유전자 치료 벡터입니다. 이 글에서, 우리는 혈우병 A 생쥐 모델에서 이 벡터의 최소 유효 선량(MED)을 결정하려고 했다. 생쥐는 정맥 꼬리 정맥 주사를 통해 4개의 벡터 선량 중 하나를 받았습니다. 한 코호트는 대조군으로 차량을 받았다. 동물들은 벡터/차량 투여 후 매일 모니터링되었습니다. 혈액 샘플은 hFVII 활성 수준과 항hFVII 항체를 평가하기 위해 수집되었습니다. 28일과 56일에 동물을 희생하고 네크롭스를 실시했습니다. 조직병리학적 검사를 위해 조직을 채취하고 혈청 화학 패널 분석을 위해 혈액을 채취했습니다. 우리는 투여된 차량과 비교하여 벡터 선량을 투여한 쥐에서 간 아미노기 전이효소 수준에 유의한 차이가 없음을 발견했습니다. 총 빌리루빈 수치는 56일 차에서 두 번의 벡터 선량 후 차량 그룹에 비해 상당히 증가했습니다. 우리는 벡터와 관련된 총체적 또는 조직학적 발견을 관찰하지 않았습니다. 대부분의 미시적 발견은 차량군에 속했으며 이 마우스 모델의 예상 표현형인 출혈에 부차적인 것으로 간주되었습니다. 선량 제한 안전 마커를 관찰하지 않았기 때문에 최대 허용 선량이 테스트된 최고 선량보다 크거나 같다고 판단했습니다. 우리는 모든 코호트 투여 벡터에서 hFVIII 활성을 검출했기 때문에, 이 연구에서 평가된 가장 낮은 선량이라고 결론짓습니다.

혈우병 A 치료에 대한 연구

혈우병 A는 인간 혈액 응고 인자 VIII(hFVIII)의 결핍을 특징으로 합니다. hFVIII 결핍의 정도에 따라 질병의 심각성은 경미한 정도에서 심각할 수 있습니다. 재조합 HFVIII의 정맥(IV) 주입을 통한 단백질 대체 요법은 효과를 발휘할 수 있습니다. 예방적으로 온화한 표현형을 유지하지만, 필요한 빈도는 환자에게 부담이 된다. 혈우병 A의 치료를 위한 AAV(Adeno-associated virus) 벡터 기반 유전자 치료는 한 번만 투여하면 되는 대체 치료 접근법을 나타낼 수 있습니다. 혈우병 A에 대한 AAV 기반 유전자 치료 접근법의 주요 제한은 hFVII 코드 서열의 크기입니다. 네이티브 hFVIII 단백질은 재조합 AAV의 포장 용량을 초과하는 상보적 DNA(cDNA)를 가진 크고 다중 도메인 당단백질입니다. 우리는 다른 사람들에 의해 수행되는 HFVIII CDNA의 크기 감소를 보완하기 위해 발현 카세트에서 프로모터 및 인핸서를 광범위하게 설계했습니다. 단백질 대체 요법 약물인 ReFacto는 B 도메인을 14-아미노산 SQ 링커로 대체함으로써 hFVIII의 최소 활성 형태를 모방하도록 성공적으로 설계되었습니다. 이 B 도메인 삭제(BDD), HFVIII-SQ(FVIII CO-SQ)의 후속 코돈 최적화는 효율적인 포장과 증가된 발현을 가져왔습니다. iviral 및 AAV 벡터. 우리는 AAV의 크기 제약 조건 내에서 코돈 최적화 BDD hFVIII 유전자의 간 특이적 발현을 유도하도록 설계된 AAVrh10 벡터를 광범위하게 평가했습니다. 5,250 bp의 총 게놈 크기 내에서, 우리는 3개의 단축된 간 특이적 프로모터와 최대 3개의 간 특이적 프로모터 조합 42개를 생성했습니다. 혈우병 A모델에서 hFVII 활성과 트랜스젠더의 면역원성을 평가한 후 캡시드 특이 면역원성 평가를 추가로 수행했습니다. 분석을 바탕으로 AAVrh10과 AAVh37 캡시드와 E03을 선택했습니다. AAVhu37의 게놈 복사본(GC)/kg을 체계적으로 투여할 때. E03.TTR.HFVIII Co-SQ.PA75에서 시노몰거스 마카크에 대한 시노몰거스 마카크에 대한 우리는 정상적인 의 피크 FVIII 활성 수준을 얻었습니다. ed항-hVIII 항체는 벡터 투여 후 30주 이내에 AAVhu37로 2개의 마카크가 투여되었습니다. E03.TTR.HFVIII Co-SQ.PA75는 연구의 초기 단계동안 항hFVIII 항체를 개발하지 않았습니다. 이러한 활동 수준은 AAVhu37 기반 유전자 치료 접근법이 심각한 혈우병 A 표현형을 수정하기에 충분하다는 것을 시사했습니다. 본 연구는 임상 후보 벡터인 AAVhu37에 대한 안전 측정을 사용한 약리학 연구를 설명합니다. E03.TTR.HFVIII Co-SQ.PA75, FVIII KO 마우스에서 최소 유효 선량(MED)을 결정하고 혈우병 A 환자의 1상 임상 시험 개시를 지원합니다.

혈우병 A치료의 최대 유효 용량 결정

이 연구에서, 우리는 임상 후보 벡터인 AAVhu37의 MED를 결정했습니다. E03.TTR.HFVIII Co-SQ.PA75, 혈우병 A 생쥐 모델입니다. 우리는 두 가지 이유로 야생형 C57BL/6 생쥐가 아닌 FVIII KO 마우스에서 실험을 수행하기로 선택했습니다. 첫째, 이 쥐 품종을 사용하면 추가적인 안전 측정과 병행하여 효능을 평가할 수 있었습니다. 둘째, 우리는 FVIII의 결함과 관련된 병리학 설정에서 잠재적인 벡터 관련 안전 징후와 관련된 심각한 혈우병 및 그 후유증을 평가하는 것을 목표로 했습니다. 우리는 모델이 간 병리학을 나타낼 것으로 기대하지 않았지만, 응고 결핍이 벡터에 대한 숙주 간의 반응에 영향을 미칠 수 있다는 것을 우려했습니다. AAVhu37의 IV 투여 후. E03.TTR.HFVIII Co-SQ. 개별 생쥐에서 항-hFVIII IgG 항체가 개발되지 않는 한, PA75, hFVII 활성은 연구 기간 동안 7일에서 56일까지 증가했습니다. 괴사 시 활성 수준이 1.4IU/mL 이상(정상의 140%에 해당)으로 검출되었습니다. FVIII 수준이 임상 효능과 직접적으로 관련이 있다는 것은 잘 확립되어 있습니다. 실제로 혈우병 A 환자는 정상 hFVIII의 비율에 따라 경도(정상의 5~40%, 0.05~0.40IU/mL), 중등도(정상의 1~5%, 0.01~0.05IU/mL), 중증(1% 이하, 0.01IU/mL)으로 분류됩니다. 이를 감안할 때, 우리의 결과는 우리의 유전자 치료 제품이 혈우병 A 환자에서 임상적 효과를 입증할 것임을 강력하게 시사합니다. 일부 FVIII KO 마우스는 항-hFVIII IgG 항체를 개발했지만, 이 벡터가 쥐에서 인간 단백질을 발현했기 때문에 이 유전자 치료 접근법의 임상적 적용과의 관련성은 알려져 있지 않습니다. 또한, 우리는 항체가 결합하는 hFVIII 단백질의 영역을 결정하지 않았습니다. 다른 연구자들은 항체 생성이 없을 때 발현과 활성을 평가하기 위해 면역 결핍 FVIII KO 마우스 모델(Rag2-/또는 CD4-/)을 사용했습니다. 우리는 벡터 선량을 투여한 생쥐에서 3 × 1011 GC/kg 투여한 한 그룹을 제외하고는 매개체 선량과 비교하여 간 아미노기 전이효소에서 유의미한 차이를 발견하지 못했습니다. 56일차에 벡터 1 × 1012 GC/kg 또는 1 × 1013 GC/kg을 투여한 후 총 빌리루빈 수치가 차량 처리 그룹에 비해 유의하게 상승했습니다. 중요한 것은, 우리는 총체적이거나 조직학적인 벡터와 관련된 병리학적 발견을 관찰하지 않았다는 것입니다. 미시적 발견의 대부분은 차량 통제를 실시한 쥐에서 이루어졌으며 출혈이나 출혈의 직접적인 증거는 관찰되지 않았지만 임상 징후와 관련하여 출혈의 증거를 가리키는 것으로 간주되었습니다. 선량 제한 벡터 관련 안전성 측정이 관찰되지 않았기 때문에 최대 허용 선량은 테스트된 최고 선량인 1 × 1013 GC/kg 이상이었습니다. 또한 혈우병 A 동물 모델에서 이 연구를 수행하여 MED를 추정할 수 있었습니다. 투여된 시험 물품의 모든 선량에서 hFVIII 활성을 검출했습니다. 항상 3 × 1011 GC/kg 이상 투여된 시험 물품 코호트에 대해 hFVIII 활성 수준이 크게 상승했습니다. 따라서 MED는 3 × 1011 GC/kg과 같습니다. E03.TTR.HFVIII Co-SQ. 다른 혈우병에 대한 PA75 유전자 치료 접근법은 사용된 혈우병 A의 다른 마우스 모델을 포함한 여러 요인에 의해 방해를 받습니다. 면역력이 있는 F8 마우스에서 rAAV8-HLP-codop-hFVIII-V3의 임상 전 평가는 2 × 1011 vg/kg 용량에서 정상 hFVIII 활성의 ~15%를 보고했으며, 이는 여기에 보고된 것(3 × 1011 GC/kg 용량에서 정상 hFVIII 활성의 17.3%)과 놀라울 정도로 유사합니다. 대조적으로, 6 × 1012 vg/kg 용량에서 BMN 270(AAV5-co-BDD-F8)의 평가는 면역결핍 Rag2--/- 마우스에서 정상 hFVII 활성의 4.9%와 FVIII와 Rag2.15 모두 높은 용량에서 정상적인 BVIII 활성의 돌연변이를 가진 10마리 중 2마리에서 검출 가능한 발현만 보여주었습니다. DKO 마우스에서 달성되었으며, 이는 1 × 1013 GC/kg의 선량에서 달성한 수준보다 상당히 낮습니다. 흥미롭게도, SB-525(AAV6-co-BDD-F8)의 임상 전 평가에서, 정상의 330% 이상 수준은 hFVIII에 허용된 생쥐에서 7.2 × 1012 vg/kg의 선량에서 관찰되었습니다. 인간이 아닌 영장류에서 동일한 벡터의 체계적인 투여에 따른 발현 데이터와 결합된 혈우병 A에 대한 이 치료 접근법에 대한 낮은 MED 때문에, 우리는 이 AAVhu37 기반 유전자 치료 접근법이 인간에게 치료 가능성을 가지고 있다고 믿습니다. 마카크에서, 1.2 × 1013 GC/kg의 IV 투여 후의 hFVII 활성 수준은 심각한 혈우병 A 표현형을 개선하기에 충분할 것이며, 따라서 재조합 hFVIII 주입의 필요성을 줄이거나 잠재적으로 제거할 수 있습니다.